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A produção ou síntese química de genes é um pilar crucial na biologia molecular moderna, auxiliando na produção de genes nativos completos e genes novos (aqueles que não ocorrem naturalmente). Além disso, o processo é a base para a produção de genomas inteiros (o conjunto completo de instruções genéticas presentes em uma célula viva).
Os avanços nas de síntese de genes significam que diversos métodos de produção de genes estão disponíveis para os interessados. No entanto, cada método tem sua aplicação específica, sintetizando genes específicos, e uma técnica não pode substituir a outra. Portanto, a seguir, apresentamos uma visão geral das técnicas comuns de síntese de genes e suas características para orientar a escolha do método mais adequado para diferentes projetos.
A produção sintética de genes é um processo gradual que facilita a produção de um gene e outros produtos gênicos sem depender de um molde de DNA. Portanto, possibilita a produção de diversos genes, incluindo genes personalizados com sequências ou pares de bases modificados.
Como mencionado anteriormente, os avanços na biotecnologia possibilitaram a existência de diversas técnicas de produção sintética de genes. No entanto, todas essas técnicas se baseiam no processo natural de produção de genes de um organismo vivo, com pequenas modificações pontuais.
Portanto, compreender o processo básico de síntese gênica ajuda a apreciar as nuances entre as técnicas de síntese de genes. Abaixo, segue uma visão geral das etapas envolvidas na síntese gênica.
Os oligonucleotídeos são pequenas cadeias de ácido nucleico (DNA ou RNA) que funcionam como blocos de construção para a produção de qualquer produto gênico, incluindo a síntese de peptídeos e proteínas. Diferentes métodos de síntese gênica empregam diferentes reagentes e técnicas para iniciar a síntese de oligonucleotídeos. No entanto, o processo ocorre na direção 3' para 5' em todos os métodos.
O recozimento consiste em aquecer moléculas como oligonucleotídeos antes de resfriá-las gradualmente para facilitar a hibridização ou a formação de uma ligação química entre duas moléculas. Diferentes métodos de síntese de genes empregam técnicas de aniquilação específicas para formar uma sequência gênica completa.
A clonagem consiste em replicar cópias da sequência genética recém-formada utilizando um vetor de clonagem.
A síntese de genes não é um processo perfeito. Portanto, a triagem de clones é necessária para identificar o gene alvo dentro dos clones. Ferramentas populares de triagem incluem kits ELISA e cromatografia.
Além da identificação do gene alvo, é necessária uma análise minuciosa dos pares de bases na sequência. Ademais, medidas corretivas para retificar erros de replicação, como deleção e substituição de bases, garantem o posicionamento correto do plasmídeo.
A seguir, apresentamos uma visão geral dos métodos e aplicações mais populares de síntese de genes.
A síntese em fase sólida é um método clássico de síntese de genes e envolve o uso de nucleosídeos quimicamente modificados, incluindo ácidos nucleicos bloqueados (LNAs), para sintetizar oligonucleotídeos alvo. Uma coluna de reagentes contendo um ácido desbloqueador retém os nucleosídeos que gradualmente formam uma cadeia de oligonucleotídeos com a desproteção de nucleosídeos subsequentes.
O processo de montagem enzimática envolve a desproteção dos nucleosídeos, seguida pelo acoplamento, capeamento e oxidação para formar uma sequência gênica a partir dos oligonucleotídeos recém-formados. A síntese em fase sólida é um processo totalmente automatizado, e os pesquisadores coletam os genes ao final. Suas vantagens incluem uma precisão notavelmente alta na obtenção da sequência gênica.
No entanto, o processo de desproteção aumenta as chances de reações secundárias, e os riscos aumentam com o aumento do comprimento. Portanto, a síntese em fase sólida produz apenas genes de 15 a 25 bases de comprimento (máximo de 200 resíduos de nucleotídeos). Tais genes têm aplicações em biologia molecular e medicina, inclusive como antisense na síntese de proteínas ou como sondas para detecção de material genético complementar.
A síntese de DNA baseada em chips é um processo de síntese genética de última geração. Ao contrário da síntese em fase sólida, que é um processo químico, a síntese baseada em chips é um processo eletroquímico.
O método utiliza chips semicondutores de microarranjos equipados com controles de temperatura para gerar múltiplos oligonucleotídeos em uma única etapa. A síntese baseada em chips complementa o processo químico tradicional do ciclo fosforamidita, criando zonas com temperatura controlada, chamadas de poços/ilhas virtuais, o que facilita a seletividade.
Além disso, facilita a detecção e correção de erros durante o processo de montagem de oligonucleotídeos e não requer uma etapa separada de análise de sequência e correção de erros. As vantagens da síntese baseada em chip incluem alto rendimento e a capacidade de gerar fragmentos de genes com pares de bases mais longos. A técnica produz sequências de genes para aplicações que exigem um alto volume de DNA alvo e baixa precisão.
A síntese de genes por PCR (reação em cadeia da polimerase) é um processo clássico que produz milhões de fragmentos de genes em duas etapas que utilizam primers. A primeira etapa consiste na montagem de nucleotídeos sobrepostos por meio de uma reação em cadeia de auto-iniciação para gerar um oligonucleotídeo de 60 pares de bases, que cobre toda a sequência.
Em seguida, uma reação de PCR subsequente gera fragmentos de DNA de 400 a 500 pares de bases. Um primer adicional amplifica o fragmento de DNA alvo. O método é ideal para aplicações que exigem fragmentos de genes longos e de alta precisão.
A síntese de genes derivada de microarranjos é indiscutivelmente o processo de produção de genes mais acessível devido ao seu baixo consumo de reagentes. Além disso, o método permite a produção multiplex, possibilitando a fabricação de milhares a dezenas de milhares de sequências de oligonucleotídeos.
Contudo, embora a diversidade de sequências de oligonucleotídeos seja uma vantagem, a montagem desses oligonucleotídeos em fragmentos de genes viáveis é um desafio devido à homologia de sequência. Portanto, o método é ideal para processos de síntese gênica personalizados que requerem quantidades muito menores de fragmentos de genes.
A síntese de genes em fase líquida também é uma técnica clássica, semelhante em muitos aspectos à síntese em fase sólida. No entanto, diferentemente da síntese em fase sólida, a geração de oligonucleotídeos ocorre em solução, e não em uma coluna de suporte. Além disso, a síntese de genes em fase líquida apresenta menor risco de reações de cadeia lateral e pode gerar fragmentos de DNA longos com erros mínimos, embora seja mais lenta.
As técnicas de síntese de genes estão em constante evolução para atender à crescente demanda por genes de alta qualidade, custo-benefício e escalabilidade. Os métodos destacados acima são os principais métodos de produção de genes, e você pode consultar seu fornecedor de serviços para determinar o método ideal para o seu projeto e orçamento.
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