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A produção ou síntese química de genes é um pilar crucial na biologia molecular moderna, ajudando a produzir genes nativos inteiros e novos genes (aqueles que não ocorrem naturalmente). Além disso, o processo é a base para a produção de genomas inteiros (o conjunto completo de instruções genéticas presentes numa célula viva).
Os avanços nas de síntese genética significam que diversos métodos de produção genética estão disponíveis para as partes interessadas. Porém, cada método tem seu nicho de aplicação, sintetizando genes específicos, e uma técnica não pode substituir outra. Portanto, abaixo está uma visão geral das técnicas comuns de síntese genética e suas características para orientar a escolha do método para diferentes projetos.
A produção de genes sintéticos é um processo gradual que facilita a produção de um gene e de outros produtos genéticos sem depender de um modelo de DNA. Portanto, facilita a produção de diversos genes, incluindo genes personalizados com sequências modificadas ou pares de bases.
Como afirmado acima, os avanços na biotecnologia significam que existem múltiplas técnicas de produção de genes sintéticos. No entanto, todas as técnicas baseiam-se no processo de produção genética nativa de um organismo vivo como base para a produção química de genes, com pequenas modificações aqui e ali.
Portanto, compreender o processo básico de síntese genética ajuda a apreciar as nuances entre as técnicas de síntese genética. Abaixo está uma visão geral das etapas envolvidas na síntese genética.
Os oligonucleotídeos são cadeias curtas de ácido nucleico (DNA ou RNA) e funcionam como o bloco de construção para a produção de qualquer produto genético, incluindo a síntese de peptídeos e proteínas. Diferentes métodos de síntese genética empregam diferentes reagentes e técnicas para iniciar a síntese de oligonucleotídeos. Contudo, o processo se move na direção 3' para 5' em todos os métodos.
O recozimento envolve o aquecimento de moléculas como os oligonucleotídeos antes de resfriá-los gradualmente para facilitar a hibridização ou a formação de uma ligação química entre duas moléculas. Diferentes métodos de síntese genética empregam técnicas únicas de aniquilação para formar uma sequência genética completa.
A clonagem envolve a replicação de cópias da sequência genética recém-formada usando um vetor de clonagem.
A síntese genética não é um processo perfeito. Portanto, a triagem de clones é necessária para identificar o gene alvo dentro dos clones. Ferramentas de triagem populares incluem kits ELISA e cromatografia.
Além de identificar o gene alvo, é necessária uma análise minuciosa dos pares de bases da sequência. Além disso, medidas corretivas para corrigir erros de replicação, como exclusão e substituição de bases, garantem o posicionamento desejável do plasmídeo.
Abaixo está uma visão geral dos métodos e aplicações de síntese genética mais populares.
A síntese em fase sólida é um método clássico de síntese genética e envolve o uso de nucleosídeos quimicamente modificados, incluindo ácidos nucleicos bloqueados (LNAs), para sintetizar oligonucleotídeos alvo. Uma coluna de reagente contendo um ácido desbloqueador contém os nucleosídeos que gradualmente formam uma cadeia oligonucleotídica com a desproteção dos nucleosídeos subsequentes.
O processo de montagem enzimática envolve o desbloqueio (desproteção) dos nucleosídeos, seguido de acoplamento, capeamento e oxidação para formar uma sequência genética a partir dos oligonucleotídeos recém-formados. A síntese em fase sólida é um processo totalmente automatizado e os pesquisadores coletam os genes no final. Suas vantagens incluem uma precisão de sequência genética notavelmente alta.
No entanto, o processo de desproteção aumenta as chances de reações colaterais e os riscos aumentam com o aumento da duração. Portanto, a síntese em fase sólida produz apenas genes de 15-25 bases de comprimento (máximo de 200 resíduos de nucleotídeos). Esses genes têm aplicações em biologia molecular e medicina, inclusive como antisense na síntese de proteínas ou como sondas para detecção de matéria genética complementar.
A síntese de DNA baseada em chip é um processo de síntese genética de próxima geração. Ao contrário da síntese em fase sólida, que é um processo químico, a síntese baseada em chip é um processo eletroquímico.
O método utiliza chips semicondutores de microarray equipados com controles de temperatura para gerar múltiplos oligonucleotídeos em uma configuração. A síntese baseada em chip complementa o processo químico tradicional do ciclo da fosforamidita, criando bolsões de zonas com temperatura controlada chamadas poços/ilhas virtuais, facilitando a seletividade.
Além disso, facilita a detecção e correção de erros durante o processo de montagem do oligonucleotídeo e não requer uma análise de sequência separada e um estágio de correção de erros. As vantagens da síntese baseada em chip incluem alto rendimento e capacidade de gerar fragmentos de genes com pares de bases mais longos. A técnica produz sequências genéticas para aplicações que exigem alto volume de DNA alvo e baixa precisão.
A síntese de genes por PCR (reação em cadeia da polimerase) é um processo clássico que produz milhões de fragmentos de genes em dois estágios que utilizam primers. O primeiro estágio é a montagem de nucleotídeos sobrepostos por meio de uma reação em cadeia de auto-escorvamento para gerar um oligonucleotídeo de 60 pb, cobrindo toda a sequência.
Em segundo lugar, uma reação de PCR subsequente gera fragmentos de DNA com 400-500 pb de comprimento. Um iniciador adicional amplifica o fragmento de DNA alvo. O método é ideal para aplicações que exigem fragmentos de genes longos e de alta precisão.
A síntese genética derivada de array é indiscutivelmente o processo de produção genética mais acessível devido ao seu baixo consumo de reagentes. Em segundo lugar, o método acomoda uma capacidade multiplex, produzindo milhares a dezenas de milhares de sequências oligonucleotídicas.
No entanto, embora as diversas sequências de oligonucleotídeos sejam uma vantagem, a montagem dos oligonucleotídeos em fragmentos de genes viáveis é um desafio devido à homologia de sequência. Portanto, o método é ideal para processos personalizados de síntese genética que requerem quantidades muito menores de fragmentos genéticos.
A síntese genética em fase líquida também é uma técnica clássica, semelhante em muitos elementos à síntese em fase sólida. No entanto, ao contrário da síntese em fase sólida, a geração de oligonucleótidos ocorre numa solução e não no suporte da coluna. Além disso, a síntese gênica em fase líquida apresenta menor risco de reação em cadeia lateral e pode gerar longos fragmentos de DNA com erros mínimos, embora mais lentos.
As técnicas de síntese genética estão em constante evolução para atender à crescente demanda por genes de alta qualidade, custo-benefício e escalabilidade. Os métodos destacados acima são os principais métodos de produção de genes, e você pode consultar seu prestador de serviços sobre o método ideal para seu projeto e orçamento.
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